Excizia HIV utilizând tehnologia CRISPR / Cas9: atacarea Cvasispeciilor Provirale în rezervoare pentru a obține un tratament | Rivoluzione

rezultate și discuții

principiile de proiectare a gRNA limitează lățimea posibilelor ținte de secvență și nu este clar câte gRNAs pot fi livrate într-un singur regim. Inițial s-a crezut că gRNAs necesită o potrivire exactă a unui primer de 20 de nucleotide urmat de NGG PAMmotif, dar cercetările recente efectuate de Hsu și colegii de muncă au descris o relație mai complicată. Există o relație neliniară între poziția neconcordanțelor și efectul asupra legării ulterioare, ceea ce înseamnă că prezicerea efectelor în afara țintei va necesita mai mult decât o abordare standard de căutare a exploziei. În plus, cerința unui motiv Pam terminal limitează și mai mult numărul de poziții țintite în genomul HIV. Ca atare, combinația acestor factori împreună cu variabilitatea SCV indică faptul că poate exista un subgrup al populației infectate cu HIV pentru care nu poate fi conceput un regim complet.

unele studii care au examinat rezervorul de celule T cu memorie CD4+ în repaus au arătat că cvasispeciile virale care pot fi induse din aceste celule încep să devină mai homeostatice cu cât pacientul este menținut mai mult pe HAART . Cu toate acestea, aceste studii nu au luat în considerare provirusul neindus. Am analizat rezultatele secvențierii de la pacienții infectați cu HIV-1 înrolați în cohorta Drexel Medicine SNC AIDS Research and Eradication Study (CARES) care arată că secvența predominantă a LTR din provirus integrat în compartimentul PBMC prezintă o scădere a cantității de variație pe an, indiferent de tipul de terapie (figura 1A), dar că acest virus suferă încă o schimbare genetică continuă a genotipului predominant în aceste celule timp de cel puțin 6 ani, în timp ce pe tra supresivă eficientă, cu o medie constantă de 10-20 mutații unice pe an pe parcursul întregului TRL (Figura 1B). Valoarea variației pe an pare să atingă un platou în jurul valorii de șase ani, dar vor fi necesare studii suplimentare pentru a documenta în continuare această observație aparentă. Având în vedere aceste rezultate, este esențial să se utilizeze secvențierea de generație următoare pentru a determina toate vq-urile prezente într-un rezervor bine controlat al pacientului. Utilizarea acestei abordări va permite proiectarea unui regim gRNA care va elimina toate vq-urile prezente cu terapia de excizie. Acest lucru ar elimina necesitatea de a înțelege dacă o anumită celulă infectată are un virus competent pentru replicare sau nu, deoarece teoretic ar elimina toate țintele HIV-1 prezente într-o anumită populație de celule.

variația genetică LTR HIV și proiectarea ARNr la pacienții bine controlați

vizite Consecutive au fost comparate prin alinierea individuală a tuturor secvențelor de la fiecare pacient folosind instrumentul de aliniere musculară și calcularea numărului de variații între vizitele consecutive. Numărul de modificări ale nucleotidelor la 100bp a fost reprezentat grafic în raport cu timpul scurs de la vizita de bază pentru a determina rata variațiilor acumulate.

a: segmentele de linie de la fiecare pacient au fost generate din variația longitudinală bazată pe statusul terapiei antiretrovirale (tra) între vizitele consecutive utilizând următoarea schemă de codificare: segmentele de linie verde indică o vizită longitudinală în care pacientul a fost naiv față de ART (21 pacienți), segmentele de linie roșie indică vizitele art oprite/neaderente (39 pacienți), segmentele de linie gri indică vizitele art on/aderente (168 pacienți) și segmentele de linie neagră/art aderente (54 pacienți) cu încărcături virale întotdeauna sub 100 de copii pe ml. Panoul superior prezintă toate probele longitudinale pe pacient. Panoul de jos prezintă deviația mediană și standard pentru fiecare grup în fiecare an.

B: LTRs de la 45 de pacienți tratați/tar aderenți și 31 de pacienți cu TAR discontinuă timp de cel puțin trei vizite consecutive au fost analizate ca în A. traiectoria fiecărui pacient este prezentată în gri cu mediana în roșu și cuartilele superioare și inferioare în albastru.

C: folosind secvențierea Roche 454 next generation (NGS), NGS pe ADN genomic izolat din Pbmc de 6 pacienți și 8 probe a fost efectuat pe un fragment de 4,4 kb al genomului HIV, așa cum a fost descris anterior . Numărul de ARNr și poziția țintă pentru fiecare pacient secvențiat a fost determinat prin alinierea secvențelor de citire scurtă la genomul HXB2 folosind aliniatorul BWA și o implementare locală a algoritmului utilizat de instrumentul de proiectare CRISPR . Ferestrele glisante de 23 mer au fost construite prin extragerea tuturor citirilor complet suprapuse și verificate pentru o secvență PAM; toate ferestrele cu mai puțin de 50 de citiri suprapuse au fost excluse. Numărul minim de ARNr necesare pentru a scinda fiecare fereastră targetable a fost calculat prin testarea tuturor ARNr posibile.

D: Citirile NGS de la pacientul 17 vizita 3 au fost mapate la HXB2 folosind aliniatorul BWA așa cum este descris mai sus și examinate pentru conservarea procentuală (linia verde) și numărul de ARNm necesare pentru excizia tuturor cvasispeciilor cunoscute (linia roșie) în fiecare poziție a LTR. Un tabel cu poziția și numărul este furnizat sub grafic.

folosind Roche 454 next generation sequencing (NGS), am efectuat NGS pe ADN genomic izolat din Pbmc de 6 pacienți și 8 probe pentru a obține o apreciere pentru conservarea LTR HIV-1 și numărul de ARNr potențial necesar pentru fiecare pacient pentru a viza toate cvasispeciile cunoscute. Datorită limitării construcției gRNA, un regim complet de gRNA ar putea fi conceput doar pentru 4 din cele 8 probe de pacient (figura 1C). Cu toate acestea, dintre cele care ar putea fi proiectate, Niciun eșantion de vizită la un pacient nu avea nevoie de mai mult de 10 gRNAs pentru a viza întreaga cvasispecie la un anumit pacient. Acest lucru arată că pentru un subset de pacienți, chiar și cei cu încărcături virale peste 50 de copii/mL, poate fi conceput un regim cu mai puțin de 10 gRNAs; invers, pentru un alt subset de pacienți, chiar dacă au încărcături virale sub 50 de copii/mL, niciun regim nu le poate exciza complet infecția.

dintre probele NGS, doi dintre cei șase pacienți au fost testați longitudinal la 11 luni distanță. Când se analizează eșantioane longitudinale de la acești pacienți, cantitatea de variație a LTR devine mai conservată (cu toate acestea, nu lipsește variația genetică) pe întreaga secvență (datele nu sunt prezentate). Unul dintre acești pacienți, pacientul a0017, prezintă un caz interesant. La vizita de admisie, moment în care au fost pe HAART timp de șase ani, pacientul a0017 nu ar fi putut fi tratat complet cu terapie de excizie CRISP/Cas9. Pe parcursul unui alt an de terapie HAART, a fost posibil să se proiecteze un regim de excizie mai mic de 10 gRNAs în diferite locuri pentru a putea acoperi toate cvasispeciile cunoscute din populația PBMC (figura 1D). Acest lucru indică faptul că vQS este o țintă în mișcare, iar fereastra terapeutică va fi limitată pentru un anumit set de gRNAs chiar și cu cele mai eficiente terapii disponibile în prezent. Acest lucru indică, de asemenea, necesitatea secvențierii la nivel de genom pentru a permite o selecție mai avansată a gRNAs din mai multe regiuni, mai degrabă decât citiri mai scurte pe care le vor oferi strategiile de secvențiere 454 sau Illumina. Luate împreună, aceste rezultate au sugerat că utilizarea tehnicilor NGS poate duce nu numai la identificarea tuturor cvasispeciilor prezente în populațiile de celule, ci și la faptul că numărul de ARNr necesare va fi suficient de scăzut pentru a putea fi ambalate în sisteme de livrare, cum ar fi oricare dintre strategiile de vectorizare virală. După cum sa demonstrat, provocarea de a viza toate Ltr-urile virale integrate va fi complexă, dar cu siguranță fezabilă.

împreună cu provocarea de a proiecta gRNAs necesare pentru excizia tuturor virusurilor integrate, cealaltă provocare majoră va fi livrarea gRNAs. O modalitate care a fost ipotezată este prin utilizarea vectorilor lentivirali. Acest tip de sistem de livrare ar permite infectarea unor tipuri de celule similare pe care HIV le infectează în mod natural, limitând potențial livrarea terapiei la celulele țintă neinfectate. Cu toate acestea, eficiența utilizării acestora pentru livrarea către celulele latente poate fi complicată atât de infectabilitatea acestor tipuri de celule, deoarece se știe că au o capacitate scăzută din cauza inactivității celulei, cât și a celulelor care au fost infectate cu HIV având un fenotip mai rezistent la infecția secundară cu HIV. O altă limitare a acestui tip de sistem va fi, fără îndoială, câte gRNAs pot fi ambalate într-un singur vector pentru a se asigura că atunci când sistemul vector lentivirus infectează o celulă, vor fi prezente toate potențialele gRNAs necesare. Care va fi limita nu a fost încă definită. În cele din urmă, cu sisteme de livrare precum vectorii lentivrus, chiar dacă obstacolele menționate mai sus pot fi depășite, livrarea gRNAs către celulele rezidente ale țesuturilor care pot avea un număr foarte mic și necesită migrarea peste barierele vasculare va fi un nivel suplimentar de provocare.

având în vedere aceste provocări, sunt necesare studii imediate pentru a explora aceste probleme. În ceea ce privește genotipul viral, prima întrebare se va concentra pe structura genetică a vq-urilor reținute în celulele rezervor, cum ar fi populația de celule T cu memorie CD4 și dacă aceste virusuri sunt similare sau semnificativ diferite de vq-urile reținute în celulele liniei monocite-macrofage și apoi să definească aceste diferențe în ceea ce privește eradicarea virală care implică direcționarea LTR? Studiile de secvențiere profundă la populații de pacienți bine definite vor trebui efectuate folosind tehnici PCR cu fragmente lungi pentru proiectarea adecvată a gRNA. În plus, compartimentarea genotipului viral în alte țesuturi poate complica imaginea cu introducerea genotipurilor virale unice în comparație cu sângele periferic. Cu toate acestea, studiile de secvențiere profundă pot constata că există regiuni virale de conservare ridicată chiar și pe mai multe țesuturi.

în al doilea rând, care sunt dinamica virală în aceste celule? Cât timp trebuie să fie un pacient pe ART pentru a conduce selecția virusului în rezervor la un nivel în care numărul de cvasispecii prezente este suficient de scăzut pentru a limita ARNm-urile necesare pentru eradicarea retenției ADN-ului proviral viral în aceste țesuturi? Va fi necesară secvențierea pacienților, în special la nivelurile de subpopulație celulară, pentru a avea o înțelegere completă a dinamicii virale la pacienții bine controlați. Această provocare poate fi abordată prin progresele înregistrate în livrarea sistemului CRISPR/Cas9, permițând casetelor mai mari de ARNr să depășească variabilitatea observată chiar și după terapia prelungită.

în cele din urmă, vor fi necesare studii ex vivo care să înceapă cu populația de celule T cu memorie pentru a determina dacă virusul poate fi eradicat din celulele derivate ale pacienților infectați cu HIV-1 într-un mediu experimental bine controlat în cadrul populațiilor de celule T cu celule unice cultivate in vitro de la pacienții infectați cu HIV-1.

în general, în timp ce acest tip de tehnologie de eradicare HIV-1 are multe provocări, perspectivele acestei tehnologii care oferă o terapie curativă rămân foarte interesante. Acest lucru este evidențiat de faptul că literatura de specialitate în acest domeniu se extinde într-un ritm rapid, precum și de faptul că, așa cum am menționat anterior, studiile clinice de fază II pentru un tratament HIV/SIDA folosind această tehnologie cu țintirea genei CCR5 sunt deja în curs . Chiar și cu această observație, este rezonabil să ne așteptăm ca acest tip de terapie să fie încă la cel puțin 5-10 ani distanță de a putea fi considerat o terapie eficientă la om. Cu toate acestea, odată cu rata în continuă schimbare a avansului experimental, probabil, cronologia va fi mai rapidă decât se aștepta. Acest lucru poate depinde de dificultățile întâmpinate în tehnologiile de livrare pentru a facilita studiile concepute pentru a ataca rezervoarele HIV-1 dincolo de sângele periferic și ganglionii limfatici regionali. În acest moment, provocările depășesc în continuare succesele de până acum în stadiile incipiente ale dezvoltării; cu toate acestea, aceasta este de obicei o afirmație adevărată pentru orice nouă abordare terapeutică. În mod evident, strategia de excizie reprezintă singura strategie terapeutică experimentală care poate realiza eliminarea completă a provirusurilor defecte și de activare competente pe bază cromozomială. În trecutul nu îndepărtat, acest lucru părea a fi un obiectiv imposibil de atins; acest lucru nu mai pare să fie cazul.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.