HIV Excisão Utilizando CRISPR/Cas9 Tecnologia: Atacar o Proviral Quasispecies em Reservatórios para Alcançar uma Cura | Rivoluzione

Resultados e Discussão

A gRNA princípios de design de limitar a amplitude da seqüência possível de alvos e não é claro quantas gRNAs pode ser entregue em um único regime. Originalmente, pensava-se que gRNAs necessitava de uma combinação exata de 20 nucleótidos primer seguido pelo NGG PAMmotif, mas pesquisas recentes da Hsu e colegas de trabalho descreveram uma relação mais complicada. Existe uma relação não linear entre a posição dos desfasamentos e o efeito na ligação subsequente, implicando que prever efeitos fora do alvo exigirá mais do que uma abordagem padrão de busca por explosão. Além disso, a exigência de um motivo PAM terminal limita ainda mais o número de posições alvo no genoma do VIH. Como tal, a combinação destes factores, juntamente com a variabilidade da QV, indica que pode existir um subgrupo da população infectada pelo VIH para o qual não é possível conceber um regime completo.

alguns estudos que examinaram o reservatório de células T de memória CD4+ em repouso demonstraram que as quasispecies virais que podem ser induzidas a partir destas células começam a tornar-se mais homeostáticas à medida que um doente é mantido em HAART . No entanto, estes estudos não consideraram o vírus provírus não induzido. Foram analisados resultados de sequenciamento de HIV-1-infected os pacientes inscritos no Drexel Medicina CNS Pesquisa da AIDS e a Erradicação de Estudo (CARES) Coorte que mostram que a predominante sequência da LTR integrados provirus dentro do PBMC compartimento apresenta uma diminuição na quantidade de variação por ano, independentemente do tipo de terapia (Figura 1A) mas o que este vírus ainda sofre continuou a alteração genética do genótipo predominante nestas células durante, pelo menos, 6 anos, enquanto em efetivo supressiva de ARTE com uma constante em média de 10 a 20 mutações únicas por ano em todo o LTR (Figura 1B). A quantidade de variação por ano parece estar a atingir um patamar próximo da marca de seis anos, mas serão necessários estudos adicionais para documentar mais esta observação aparente. Tendo em conta estes resultados, é essencial utilizar sequenciação de próxima geração para determinar todos os QV presentes no reservatório de um doente bem controlado. Usando esta abordagem permitirá o design de um regime gRNA que irá eliminar todos os vQS presentes com terapia de excisão. Isso eliminaria a necessidade de entender se uma determinada célula infectada tem um vírus competente para replicação ou não, como em teoria eliminaria todos os alvos de HIV-1 presentes dentro de uma dada população celular.

as variações genéticas do LTR do VIH e o desenho do gRNA em doentes bem controlados

as visitas consecutivas foram comparadas alinhando individualmente todas as sequências de cada doente utilizando a ferramenta de alinhamento muscular e calculando o número de variações entre as visitas consecutivas. O número de alterações de nucleótidos por 100bp foi mapeado em relação ao tempo desde a visita inicial para determinar a taxa de variações acumuladas.

A: os segmentos de linha de cada doente foram gerados a partir da variação longitudinal baseada no Estatuto da terapêutica anti-retroviral (ARV) entre visitas consecutivas, utilizando o seguinte esquema de codificação: linha verde segmentos de indicar um longitudinal visita em que o paciente foi ingênuo ARTE (21 pacientes), vermelho segmentos de linha indicam desligado/não aderente ARTE visitas (39 pacientes), cinza segmentos de linha de indicar/aderente de ARTE visitas (168 pacientes), e preto segmentos de linha em/aderente de ARTE (54 pacientes) com cargas virais sempre inferior a 100 cópias por ml. O painel superior retrata todas as amostras longitudinais por doente. O painel inferior mostra mediana e desvio padrão para cada grupo em cada ano.

B: LTRs de 45 pacientes/aderente de ARTE e 31 pacientes com descontínuo de ARTE para, pelo menos, três visitas consecutivas foram analisados como em A. A trajetória de cada paciente é mostrada em cinza, com a mediana em vermelho e os quartis superior e inferior em azul.

C: utilizando sequenciação de Roche 454 next generation (NGS), NGS on genomic DNA isolated from PBMCs of 6 patients and 8 samples was performed on a 4.4 kb fragment of the HIV genome, as previously described . O número de gRNAs e posição-alvo para cada paciente sequenciado foi determinado alinhando as sequências de Leitura curta ao genoma HXB2 usando o aligner BWA e uma implementação local do algoritmo usado pela ferramenta CRISPR design . 23-mer as janelas de correr foram construídas extraindo todas as leituras completamente sobrepostas e verificadas para uma sequência PAM; todas as janelas com menos de 50 leituras sobrepostas foram excluídas. O número mínimo de gRNAs necessário para clivear cada janela targetable foi calculado testando todos os gRNAs possíveis.

D: NGS lê a partir do paciente 17 visita 3 foram mapeados para HXB2 usando o aligner BWA como descrito acima e examinado para a conservação por cento (linha verde) e número de gRNAs necessários para a excisão de todas as quasispecies conhecidas (linha vermelha) em todas as posições do LTR. Uma tabela da posição e do número é fornecida abaixo do gráfico.

Utilizando Roche 454 próxima geração de sequenciamento (NGS), temos realizado NGS em DNA genômico isolado de PBMCs de 6 pacientes e 8 amostras para apreciar a conservação do HIV-1 L e o número de gRNAs potencialmente necessários por paciente para o destino de todos os conhecidos quasispecies. Devido à limitação da construção do gRNA, um regime gRNA completo só podia ser concebido para 4 das 8 amostras de doentes (figura 1C). No entanto, dos que podem ser projetados, ninguém precisa de mais de 10 gRNAs para atingir os quasispecies inteiros em um determinado paciente. Isto mostra que, para um subgrupo de doentes, mesmo aqueles com cargas virais superiores a 50 cópias/mL, pode ser concebido um regime com menos de 10 gRNAs; inversamente, para outro Subgrupo de doentes, mesmo que tenham cargas virais inferiores a 50 cópias/mL, nenhum regime pode excisar completamente a sua infecção.Das amostras de NGS, dois dos seis doentes foram testados longitudinalmente com um intervalo de 11 meses. Ao olhar para amostras longitudinais destes pacientes, a quantidade de variação no LTR torna-se mais conservada (no entanto, não falta de variação genética) em toda a sequência (dados não mostrados). Um destes pacientes, o paciente A0017, apresenta um caso interessante. Na visita de admissão, altura em que estavam em HAART há seis anos, o doente a0017 não podia ter sido completamente tratado com terapia de excisão CRISP/Cas9. Ao longo de outro ano de terapia HAART, foi possível projetar um regime de excisão de menos de 10 gRNAs em vários locais para ser capaz de cobrir todos os quasispecies conhecidos da população PBMC (figura 1D). Isto indica que o vQS é um alvo em movimento e a janela terapêutica será limitada para um determinado conjunto de gRNAs, mesmo com as terapias mais eficazes actualmente disponíveis. Isto também indica a necessidade de sequenciamento em um nível de genoma para permitir uma seleção mais avançada de gRNAs de várias regiões, em vez de leituras mais curtas que 454 ou estratégias de sequenciamento ilumina irão fornecer. Em conjunto, estes resultados sugeriram que a utilização de técnicas NGS pode resultar não só na identificação de todas as quasispecies presentes nas populações de células, mas também que o número de gRNAs necessário será suficientemente baixo para ser potencialmente embalado em sistemas de entrega, como qualquer uma das várias estratégias de vectoração viral. Como demonstrado, o desafio de direcionar todos os LTRs virais integrados será complexo, mas certamente viável.

juntamente com o desafio de projetar as gRNAs necessárias para a excisão de todos os vírus integrados, o outro grande desafio será a entrega das gRNAs. Uma das hipóteses é o uso de vectores lentivíricos. Este tipo de Sistema de administração permitiria a infecção de tipos de células semelhantes que o VIH infecta naturalmente, limitando potencialmente o fornecimento da terapêutica a células alvo não infectadas. No entanto, a eficiência da utilização destas para entregar a latente células pode ser complicada por ambos os infectability desses tipos de células, como são conhecidos para ter uma diminuição da capacidade devido à inatividade da célula, bem como células, que foram infectados pelo HIV mais resistente fenótipo secundária a infecção pelo HIV. Outra limitação deste tipo de sistema será, sem dúvida, quantas gRNAs podem ser empacotadas em um vetor para garantir que quando o sistema Vetor de lentivírus infecta uma célula que todo o potencial gRNAs necessário estará presente. Qual será o limite ainda não foi definido. Por último, com sistemas de distribuição como os vectores lentivrus, mesmo que os obstáculos acima mencionados possam ser ultrapassados, a entrega dos gRNAs às células residentes nos tecidos, que podem ter um número muito baixo e exigir migração através das barreiras vasculares, constituirá um nível adicional de desafio.Dados estes desafios, são necessários estudos imediatos para explorar estas questões. Com relação ao genótipo viral a primeira pergunta que vai do centro sobre a composição genética do vQS retida no reservatório de células como o CD4 de memória T-população de células, e se estes vírus são semelhantes ou significativamente diferente do que o vQS retidos nas células da monócitos-macrófagos de linhagem e, em seguida, para definir essas diferenças com relação à erradicação viral envolvendo LTR segmentação? Os estudos de sequenciação profunda em populações de doentes bem definidas terão de ser realizados utilizando técnicas de PCR de fragmentos longos para a concepção correcta do gRNA. Além disso, a compartimentação viral noutros tecidos pode complicar o quadro com a introdução de genótipos virais únicos em comparação com o sangue periférico. No entanto, estudos de sequenciação profunda podem descobrir que existem regiões virais de alta conservação mesmo em vários tecidos.

em segundo lugar, quais são as dinâmicas virais nestas células? Quanto tempo deve o paciente ser sobre ARTE para a unidade de vírus seleção no reservatório para um nível onde o número de quasispecies presente é baixo o suficiente para limitar o gRNAs necessários para erradicar a retenção de viral DNA proviral em tecidos? A sequenciação de pacientes, especialmente em níveis de subpopulação celular, para ter uma compreensão completa da dinâmica viral em pacientes bem controlados será necessária. Este Desafio pode ser enfrentado através de avanços no fornecimento do sistema CRISPR/Cas9, permitindo que as cassetes maiores de gRNAs superem a variabilidade observada mesmo após uma terapêutica prolongada.

finalmente, serão necessários estudos de conceito ex vivo a partir da população de células T da memória para determinar se o vírus pode ser erradicado de células derivadas de doentes infectados pelo VIH-1 num ambiente experimental bem controlado dentro de populações de células T de células únicas cultivadas in vitro a partir de doentes infectados pelo VIH-1.

globalmente, embora este tipo de tecnologia de erradicação do VIH-1 tenha muitos desafios, as perspectivas desta tecnologia de proporcionar uma terapia curativa continuam a ser muito empolgantes. Isto é evidenciado pelo fato de que a literatura nesta área está se expandindo a um ritmo rápido, bem como pelo fato de que, como mencionado anteriormente, os ensaios clínicos de fase II para um tratamento do HIV/AIDS usando esta tecnologia com enfoque de gene CCR5 já está em andamento . Mesmo com esta observação, é razoável esperar que este tipo de terapia ainda está a pelo menos 5-10 anos de ser considerado como uma terapia eficaz no ser humano. No entanto, com a taxa sempre em mudança de avanço experimental talvez a linha do tempo será mais rapidamente do que o esperado. Isto pode depender de dificuldades encontradas nas tecnologias de administração para facilitar estudos concebidos para atacar reservatórios de VIH-1 Para além do sangue periférico e gânglios linfáticos regionais. Neste ponto, os desafios ainda superam os sucessos até agora nas fases iniciais do desenvolvimento; no entanto, esta é geralmente uma verdadeira afirmação para qualquer nova abordagem terapêutica. Claramente, a estratégia de excisão representa a única estratégia terapêutica experimental que pode alcançar a eliminação completa de proviros com base em cromossomas defeituosos e ativação competentes. No passado não distante, este parecia ser um objetivo inalcançável; isso já não parece ser o caso.

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