Wycięcie HIV z wykorzystaniem technologii CRISPR / Cas9: atakowanie Proviral Quasispecies w zbiornikach w celu osiągnięcia lekarstwa | Rivoluzione

wyniki i dyskusja

zasady projektowania gRNA ograniczają szerokość możliwych celów sekwencji i nie jest jasne, ile grna można dostarczyć w jednym schemacie. Początkowo uważano, że gRNAs wymaga dokładnego dopasowania startera nukleotydowego 20, a następnie NGG PAMmotif, ale ostatnie badania Hsu i współpracowników opisały bardziej skomplikowaną zależność. Istnieje nieliniowa zależność między położeniem niedopasowania a wpływem na późniejsze Wiązanie, co oznacza, że przewidywanie efektów poza celem będzie wymagało czegoś więcej niż standardowe podejście do wyszukiwania wybuchu. Ponadto wymóg stosowania końcowego motywu PAM dodatkowo ogranicza liczbę docelowych pozycji w genomie HIV. Jako takie, połączenie tych czynników wraz ze zmiennością vQS wskazuje, że może istnieć podgrupa populacji zakażonej HIV, dla której nie można zaprojektować pełnego schematu leczenia.

niektóre badania, w których zbadano spoczynkowy zbiornik limfocytów T pamięci CD4+ wykazały, że quazispecies wirusowe, które mogą być indukowane z tych komórek, zaczynają stawać się bardziej homeostatyczne, im dłużej pacjent jest utrzymywany na HAART . Jednak w badaniach tych nie uwzględniono niezauważonego prowirusa. Przeanalizowaliśmy wyniki sekwencjonowania od pacjentów zakażonych HIV-1 włączonych do kohorty Drexel Medicine CNS AIDS Research and Eradykation Study (CARES), które pokazują, że dominująca Sekwencja LTR ze zintegrowanego prowirusa w kompartmencie PBMC wykazuje zmniejszenie ilości zmienności rocznie, niezależnie od rodzaju terapii (Fig. (Rys. 1B). Ilość zmienności rocznie wydaje się być osiągnięcie plateau wokół znaku sześciu lat, ale dodatkowe badania będą wymagane do dalszego udokumentowania tej widocznej obserwacji. Biorąc pod uwagę te wyniki, konieczne jest zastosowanie sekwencjonowania nowej generacji w celu określenia wszystkich vQS obecnych w dobrze kontrolowanym zbiorniku pacjenta. Zastosowanie tego podejścia pozwoli na zaprojektowanie schematu gRNA, który wyeliminuje wszystkie vQS obecne z terapią wycięcia. Wyeliminowałoby to potrzebę zrozumienia, czy dana zakażona komórka ma wirusa właściwego do replikacji, czy też nie, ponieważ teoretycznie wyeliminowałoby to wszystkie cele HIV-1 obecne w danej populacji komórek.

porównano zmienność genetyczną LTR HIV i projektowanie gRNA u dobrze kontrolowanych pacjentów

kolejnych wizyt poprzez indywidualne dopasowanie wszystkich sekwencji u każdego pacjenta za pomocą narzędzia do wyrównywania mięśni i obliczenie liczby różnic między kolejnymi wizytami. Liczbę zmian nukleotydów na 100bp wykreślono w stosunku do czasu od wizyty wyjściowej w celu określenia szybkości skumulowanych zmian.

A: segmenty linii od każdego pacjenta były generowane na podstawie zmian podłużnych w oparciu o stan terapii przeciwretrowirusowej (ART) między kolejnymi wizytami przy użyciu następującego schematu kodowania: segmenty zielonej linii wskazują na wizytę podłużną, w której pacjent nie był wcześniej leczony ART (21 pacjentów), segmenty czerwonej linii wskazują na wizyty off / non-adherent ART (39 pacjentów), segmenty szarej linii wskazują na wizyty on/adherent ART (168 pacjentów), a segmenty czarnej linii on/adherent ART (54 pacjentów) z mianem wirusa zawsze poniżej 100 kopii na ml. Górny panel przedstawia wszystkie podłużne próbki na pacjenta. Dolny panel pokazuje medianę i odchylenie standardowe dla każdej grupy w każdym roku.

B: Analizowano LTRs od 45 pacjentów na / adherent ART i 31 pacjentów z nieciągłymi ART przez co najmniej trzy kolejne wizyty jak w A. trajektoria każdego pacjenta jest pokazana w kolorze szarym z medianą w kolorze czerwonym i górnym i dolnym kwartylem w Kolorze Niebieskim.

C: wykorzystując Roche 454 next generation sequencing (NGS), NGS na genomowym DNA wyizolowanym z PBMC 6 pacjentów i 8 próbek przeprowadzono na fragmencie 4,4 kb genomu HIV, jak wcześniej opisano . Liczba grna i pozycja docelowa dla każdego zsekwencjonowanego pacjenta została określona przez dopasowanie sekwencji krótkoczytalnych do genomu HXB2 przy użyciu alignera BWA i lokalnej implementacji algorytmu używanego przez narzędzie CRISPR design tool . Okna przesuwne 23-mer zostały skonstruowane przez wyodrębnienie wszystkich CAŁKOWICIE nakładających się odczytów i sprawdzenie sekwencji PAM; wszystkie okna z mniej niż 50 nakładającymi się odczytami zostały wykluczone. Minimalna liczba grna wymagana do rozszczepiania każdego okna targetable została obliczona poprzez przetestowanie wszystkich możliwych grna.

D: Odczyty NGS z wizyty pacjenta 17 3 zostały zmapowane do HXB2 przy użyciu aligatora BWA, jak opisano powyżej i zbadane pod kątem zachowania procentowego (zielona linia) i liczby grna niezbędnych do wycięcie wszystkich znanych quasispecies (czerwona linia) w każdej pozycji LTR. Tabela pozycji i liczby znajduje się pod wykresem.

wykorzystując Roche 454 next generation sequencing (NGS), wykonaliśmy NGS na genomowym DNA wyizolowanym z PBMC 6 pacjentów i 8 próbek, aby zyskać uznanie dla zachowania HIV-1 LTR i liczby grna potencjalnie potrzebnych na pacjenta do ukierunkowania wszystkich znanych quasispecies. Ze względu na ograniczenie konstrukcji gRNA, kompletny schemat grna można było zaprojektować tylko dla 4 z 8 próbek pacjentów (Fig. 1C). Jednak spośród tych, które można było zaprojektować, Żadna próbka odwiedzin pacjenta nie potrzebowała więcej niż 10 grna, aby nakierować na całe quasispecies u danego pacjenta. To pokazuje, że dla podgrupy pacjentów, nawet tych z wiremia powyżej 50 kopii/mL, można opracować schemat z mniej niż 10 grna; odwrotnie, dla innej podgrupy pacjentów, nawet jeśli mają wiremia poniżej 50 kopii/mL, żaden schemat nie może całkowicie ograniczyć ich zakażenia.

spośród próbek NGS dwóch z sześciu pacjentów poddano badaniu wzdłużnemu w odstępie 11 miesięcy. Patrząc na podłużne próbki od tych pacjentów, wielkość zmienności LTR staje się bardziej zachowana (jednak nie pozbawiona zmienności genetycznej) w całej sekwencji (dane nie pokazane). Jeden z tych pacjentów, pacjent a0017, przedstawia interesujący przypadek. Podczas wizyty, w której pacjent był na HAART przez sześć lat, pacjent a0017 nie mógł być całkowicie leczony terapią CRISP / Cas9. W ciągu kolejnego roku terapii HAART możliwe było zaprojektowanie schematu wycinania mniej niż 10 grna w różnych miejscach, aby móc objąć wszystkie znane quazispecies z populacji PBMC (rycina 1D). Oznacza to, że vQS jest ruchomym celem, a okno terapeutyczne będzie ograniczone dla danego zestawu grna, nawet przy najskuteczniejszych obecnie dostępnych terapiach. Wskazuje to również na potrzebę sekwencjonowania na poziomie genomu, aby umożliwić bardziej zaawansowany wybór grna z wielu regionów, a nie krótsze odczyty, które zapewnią strategie sekwencjonowania 454 lub Illumina. Łącznie wyniki te sugerują, że stosowanie technik NGS może skutkować nie tylko identyfikacją wszystkich quazispecies obecnych w populacjach komórkowych, ale także, że liczba potrzebnych grna będzie wystarczająco niska, aby potencjalnie zostać zapakowana w systemy dostarczania, takie jak dowolna z wielu strategii wektorowania wirusów. Jak wykazano, wyzwanie ukierunkowane na wszystkie zintegrowane wirusowe ltr będzie złożone, ale z pewnością wykonalne.

wraz z wyzwaniem zaprojektowania grna niezbędnych do wycięcia wszystkich zintegrowanych wirusów, innym poważnym wyzwaniem będzie dostarczenie grna. Jedną z hipotez jest użycie wektorów lentiwirusowych. Ten typ systemu dostarczania umożliwiłby zakażenie podobnych typów komórek, które HIV naturalnie infekuje, potencjalnie ograniczając dostarczanie terapii do niezakażonych komórek docelowych. Jednak skuteczność wykorzystania ich do dostarczania do komórek utajonych może być skomplikowana zarówno przez zakaźność tych typów komórek, ponieważ wiadomo, że mają one zmniejszoną zdolność z powodu nieaktywności komórki, jak również komórek, które zostały zainfekowane przez HIV o bardziej opornym fenotypie na wtórne zakażenie HIV. Innym ograniczeniem tego typu systemu będzie niewątpliwie to, ile grna można zapakować w jeden wektor, aby zapewnić, że gdy system wektorów lentywirusa zainfekuje komórkę, wszystkie potrzebne potencjalne grna będą obecne. To, jaki będzie limit, nie zostało jeszcze określone. Wreszcie z systemami dostarczania, takimi jak wektory lentivrus, nawet jeśli wyżej wymienione przeszkody mogą zostać przekroczone, dostarczenie grna do komórek rezydujących w tkankach, które mogą mieć bardzo małą liczbę i wymagać migracji przez bariery naczyniowe, będzie dodatkowym wyzwaniem.

biorąc pod uwagę te wyzwania, potrzebne są natychmiastowe badania, aby zbadać te problemy. W odniesieniu do genotypu wirusa pierwsze pytanie będzie koncentrować się na genetycznym składzie vQS zatrzymanych w komórkach rezerwuarowych, takich jak populacja limfocytów T pamięci CD4 i czy wirusy te są podobne lub znacząco różne od vQS zatrzymanych w komórkach linii monocytowo-makrofagowej, a następnie określić te różnice w odniesieniu do eradykacji wirusowej obejmującej celowanie w LTR? Głębokie sekwencjonowanie badania w dobrze zdefiniowanych populacjach pacjentów będą musiały być wykonywane przy użyciu długich fragmentów PCR technik dla właściwego projektowania gRNA. Ponadto, podział genotypu wirusa w innych tkankach może skomplikować obraz z wprowadzeniem unikalnych genotypów wirusowych w porównaniu do krwi obwodowej. Jednak, głębokie sekwencjonowanie studia mogą odkrywać że tam są wirusowe regiony wysoki Ochrona nawet w wielorakich tkankach.

po drugie, jaka jest dynamika wirusów w tych komórkach? Jak długo pacjent musi być na ART, aby doprowadzić selekcję wirusów w zbiorniku do poziomu, w którym liczba obecnych quasispecies jest wystarczająco niska, aby ograniczyć grna potrzebne do wyeliminowania retencji wirusowego proviral DNA w tych tkankach? Sekwencjonowanie pacjentów, zwłaszcza na poziomie subpopulacji komórek, aby mieć pełne zrozumienie dynamiki wirusów u dobrze kontrolowanych pacjentów będzie wymagane. Wyzwanie to można rozwiązać dzięki postępom w dostarczaniu systemu CRISPR / Cas9, umożliwiając większe kasety grna przezwyciężenie zmienności obserwowanej nawet po długotrwałej terapii.

wreszcie, badania ex vivo proof-of-concept, rozpoczynające się od populacji komórek T pamięci, będą wymagane w celu ustalenia, czy wirus może zostać wyeliminowany z komórek pochodzących od pacjentów zakażonych HIV – 1 w dobrze kontrolowanym środowisku doświadczalnym w populacjach pojedynczych komórek T hodowanych in vitro od pacjentów zakażonych HIV-1.

Ogólnie rzecz biorąc, podczas gdy ten typ technologii eradykacji HIV-1 ma wiele wyzwań, perspektywy tej technologii dostarczania terapii leczniczej pozostają bardzo ekscytujące. Podkreśla to fakt, że literatura w tej dziedzinie rozwija się w szybkim tempie, jak również fakt, że jak wspomniano wcześniej, prowadzone są już badania kliniczne II Fazy dotyczące leczenia HIV/AIDS przy użyciu tej technologii z ukierunkowaniem na gen CCR5 . Nawet z tą obserwacją, uzasadnione jest oczekiwanie, że ten rodzaj terapii jest jeszcze co najmniej 5-10 lat od bycia uznanym za skuteczną terapię u ludzi. Jednak przy stale zmieniającym się tempie postępu eksperymentalnego być może oś czasu będzie szybsza niż oczekiwano. Może to zależeć od trudności napotkanych w technologiach dostarczania w celu ułatwienia badań mających na celu atakowanie zbiorników HIV-1 poza krwią obwodową i regionalnymi węzłami chłonnymi. W tym momencie wyzwania nadal przeważają nad dotychczasowymi sukcesami we wczesnych stadiach rozwoju; jednak zwykle jest to prawdziwe stwierdzenie dla każdego nowego podejścia terapeutycznego. Oczywiście, strategia wycięcia stanowi jedyną eksperymentalną strategię terapeutyczną, która może osiągnąć całkowitą eliminację wadliwych i kompetentnych prowirusów opartych na chromosomach. W niedalekiej przeszłości wydawało się to nieosiągalnym celem; wydaje się, że już tak nie jest.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.