HIV Excision Utnytte CRISPR / Cas9 Teknologi: Angripe Proviral Quasispecies I Reservoarer For Å Oppnå En Kur | Rivoluzione

Resultater Og Diskusjon

gRNA design prinsipper begrense bredden av mulige sekvensmål, og det er uklart hvor mange grna kan leveres i en enkelt diett. Opprinnelig ble det antatt at gRNAs krevde en nøyaktig match av en 20 nukleotidprimer etterfulgt av NGG PAMmotif, men nyere forskning Av Hsu og kollegaer har beskrevet et mer komplisert forhold. Det er et ikke-lineært forhold mellom posisjonen til uoverensstemmelser og effekten på påfølgende binding, noe som innebærer at forutsi off-target effekter vil kreve mer enn en standard BLAST søk tilnærming. Videre begrenser kravet til et terminalt pam-motiv ytterligere antall målbare stillinger i HIV-genomet. Kombinasjonen av disse faktorene sammen med variabiliteten til vQS indikerer at DET kan være en undergruppe AV DEN HIV-infiserte populasjonen som et komplett regime ikke kan utformes for.

noen studier som har undersøkt HVILENDE CD4 + minne T – celle reservoar har vist at virale kvasearter som kan induseres fra disse cellene begynner å bli mer homeostatiske jo lenger en pasient opprettholdes PÅ HAART . Imidlertid vurderte disse studiene ikke det uninduced proviruset. Vi har analysert sekvenseringsresultater fra HIV-1-infiserte pasienter registrert i DREXEL Medicine Cns AIDS Research And Eradication Study (CARES) Kohorten som viser at DEN dominerende SEKVENSEN AV LTR fra integrert provirus i PBMC-rommet viser en reduksjon i mengden variasjon per år uavhengig av type terapi (Figur 1a), men at dette viruset fortsatt gjennomgår fortsatt genetisk endring av den dominerende genotypen i disse cellene i minst 6 år mens de er på effektiv undertrykkende ART med en konstant median på 10-20 unike mutasjoner per år gjennom HELE LTR (Figur 1b). Mengden variasjon per år ser ut til å nå et platå rundt seksårsmerket, men det vil bli nødvendig med flere studier for å dokumentere denne tilsynelatende observasjonen. Gitt disse resultatene, er det viktig å bruke neste generasjons sekvensering for å bestemme alle vQS som er tilstede i en velkontrollert pasients reservoar. Ved hjelp av denne tilnærmingen vil tillate utformingen av en gRNA regime som vil eliminere alle vQS til stede med excision terapi. Dette ville eliminere behovet for å forstå om en gitt infisert celle har et replikasjonskompetent virus eller ikke, da det i teorien ville eliminere ALLE HIV-1-mål som er tilstede i en gitt cellepopulasjon.

HIV LTR genetisk variasjon og gRNA-design hos velkontrollerte pasienter

Påfølgende besøk ble sammenlignet ved å individuelt tilpasse alle sekvenser fra hver pasient ved hjelp AV MUSKELJUSTERINGSVERKTØYET og beregne antall variasjoner mellom påfølgende besøk. Antall nukleotidendringer per 100bp ble plottet mot tiden siden baseline besøk for å bestemme frekvensen av akkumulerte variasjoner.

A: Linjesegmenter fra hver pasient ble generert fra den langsgående variasjonen basert på ANTIRETROVIRAL behandlingsstatus (ART) mellom påfølgende besøk ved hjelp av følgende kodesystem: grønne linjesegmenter indikerer et longitudinelt besøk der pasienten var naiv OVERFOR ART (21 pasienter), røde linjesegmenter indikerer off/non-adherent ART-besøk (39 pasienter), grå linjesegmenter indikerer on/adherent ART-besøk (168 pasienter), og svarte linjesegmenter på/adherent ART (54 pasienter) med virusbelastning alltid under 100 kopier per ml. Topppanelet viser alle langsgående prøver per pasient. Bunnpanelet viser median og standardavvik for hver gruppe hvert år.

B: Ltr fra 45 PASIENTER på/adherent ART og 31 pasienter med diskontinuerlig ART i minst tre påfølgende besøk ble analysert Som I A. banen til hver pasient er vist i grått med median i rødt og øvre og nedre kvartil i blått.

C: Ved Bruk Av roche 454 next generation sequencing (NGS) ble NGS på genomisk DNA isolert fra Pbmcer av 6 pasienter og 8 prøver utført på et 4,4 kb fragment AV HIV-genomet, som tidligere beskrevet . Antall grnaer og målposisjon for hver pasient sekvensert ble bestemt ved å tilpasse de kortleste sekvensene TIL HXB2-genomet ved HJELP AV BWA-reguleringen og en lokal implementering av algoritmen som BRUKES AV CRISPR-designverktøyet . 23-mer skyvevinduer ble konstruert ved å trekke ut alle helt overlappende leser og sjekket for EN PAM-sekvens; alle vinduer med mindre enn 50 overlappende leser ble utelukket. Det minimale antallet gRNAs som kreves for å spalte hvert målrettbart vindu ble beregnet ved å teste alle mulige gRNAs.

D: NGS leser fra pasient 17 besøk 3 ble kartlagt TIL HXB2 ved HJELP AV BWA aligner som beskrevet ovenfor og undersøkt for prosent bevaring (grønn linje) og antall gRNAs nødvendig for excision av alle kjente kvasispecies (rød linje) i HVER POSISJON AV LTR. En tabell over posisjon og nummer er gitt under grafen.

Ved Å Benytte Roche 454 next generation sequencing (NGS), har vi utført NGS på genomisk DNA isolert fra Pbmcer av 6 pasienter og 8 prøver for å få en forståelse for bevaring AV HIV-1 LTR og antall grna potensielt nødvendig per pasient for å målrette alle kjente kvasearter. På grunn av begrensningen av grna-konstruksjon, kunne et komplett gRNA-regime bare utformes for 4 av de 8 pasientprøvene(Figur 1c). Men av de som kunne utformes, trengte ingen pasientbesøk prøve mer enn 10 gRNAs for å målrette hele kvasispecies i en gitt pasient. Dette viser at for en delmengde av pasienter, selv de med virusbelastning over 50 kopier / mL, kan et regime med mindre enn 10 grna utarbeides; omvendt, for en annen delmengde av pasienter, selv om de har virusbelastning under 50 kopier / mL, kan ingen diett helt utelukke infeksjonen.

av ngs-prøvene ble to av de seks pasientene testet i lengderetningen med 11 måneders mellomrom. Når man ser på langsgående prøver fra disse pasientene, blir variasjonen i LTR mer bevart (men mangler ikke genetisk variasjon) over hele sekvensen (data ikke vist). En av disse pasientene, pasient A0017, presenterer et interessant tilfelle. Ved inntaksbesøket, hvor de hadde vært på HAART i seks år, kunne Pasient A0017 ikke ha blitt fullstendig behandlet med CRISP/Cas9 excision terapi. I løpet av et annet år MED HAART-terapi var det mulig å designe et eksisjonsregime på mindre enn 10 gRNAs på forskjellige steder for å kunne dekke alle kjente kvasispecies fra PBMC-populasjonen (Figur 1d). Dette indikerer at vQS er et bevegelig mål, og det terapeutiske vinduet vil være begrenset for et gitt sett med gRNAs selv med de mest effektive terapiene som er tilgjengelige. Dette indikerer også behovet for sekvensering på et genom nivå for å tillate mer avansert utvalg av gRNAs fra flere regioner i stedet for kortere leser at 454 Eller Illumina sekvensering strategier vil gi. Samlet sett har disse resultatene antydet at BRUK AV ngs-teknikker kan resultere i ikke bare å identifisere alle kvasispecies som er tilstede i cellepopulasjoner, men også at antall grnaer som trengs, vil være lave nok til potensielt å bli pakket inn i leveringssystemer som noen av en rekke virale vektorstrategier. Som demonstrert vil utfordringen med å målrette mot alle de integrerte virale Ltr-Ene være komplekse, men absolutt gjennomførbare.

sammen med utfordringen med å designe gRNAs som er nødvendig for utskjæring av alt integrert virus, vil den andre store utfordringen være levering av gRNAs. En måte som har blitt hypotese er gjennom bruk av lentivirale vektorer. Denne typen leveringssystem vil tillate infeksjon av lignende celletyper SOM HIV naturlig infiserer, potensielt begrenser leveransen av terapien til uinfiserte off-målceller. Effektiviteten ved å bruke disse til å levere til latente celler kan imidlertid være komplisert av både infeksjonsevnen til disse typer celler, da de er kjent for å ha redusert evne på grunn av inaktiviteten til cellen, så vel som celler, som har blitt infisert AV HIV som har en mer resistent fenotype til sekundær HIV-infeksjon. En annen begrensning av denne typen system vil utvilsomt være hvor mange gRNAs som kan pakkes inn i en vektor for å sikre at når lentivirus vektorsystemet infiserer en celle som alle potensielle gRNAs som trengs, vil være til stede. Hva grensen vil være har ennå ikke definert. Til slutt med leveringssystemer som lentivrus vektorer selv om de ovennevnte hindrene kan overgås, vil levering av gRNAs til vevsboende celler som kan ha svært lave tall og kreve migrasjon over vaskulære barrierer være et ekstra nivå av utfordring.

Gitt disse utfordringene, er det nødvendig med umiddelbare studier for å utforske disse problemene. Med hensyn til viral genotype det første spørsmålet vil fokusere på den genetiske sammensetningen av vQS beholdt i reservoarceller som CD4 minne T-celle populasjonen og om disse virusene er lik eller vesentlig forskjellig fra vQS beholdt i celler av monocyte-makrofag avstamning og deretter å definere disse forskjellene med hensyn til viral utrydding involverer LTR målretting? Dype sekvenseringsstudier i veldefinerte pasientpopulasjoner må utføres ved hjelp av lange fragment PCR-teknikker for riktig gRNA-design. Videre kan viral genotype compartmentalization i andre vev komplisere bildet med innføringen av unike viral genotyper i forhold til perifert blod. Imidlertid kan dype sekvenseringsstudier finne at det er virale regioner med høy bevaring selv over flere vev.

For Det Andre, Hva er den virale dynamikken i disse cellene? Hvor lenge må EN PASIENT være PÅ ART for å drive virusvalg i reservoaret til et nivå der antall kvasispecies tilstede er lavt nok til å begrense gRNAs som trengs for å utrydde oppbevaring av virus proviralt DNA i disse vevene? Sekvensering av pasienter, spesielt på celle subpopulasjon nivåer, for å ha en fullstendig forståelse av viral dynamikk i velkontrollerte pasienter vil være nødvendig. Denne utfordringen kan løses ved fremskritt i leveransen AV CRISPR / Cas9-systemet, slik at større kassetter av gRNAs kan overvinne variabiliteten observert selv etter langvarig behandling.

til Slutt vil ex vivo proof-of-concept-studier som begynner med minne-t-cellepopulasjonen være nødvendig for å avgjøre om virus kan utryddes FRA HIV-1-infiserte pasientavledede celler i et godt kontrollert eksperimentelt miljø innenfor enkeltcelle T-cellepopulasjoner dyrket in vitro fra HIV-1-infiserte pasienter.

Alt I Alt, Mens DENNE TYPEN HIV-1 utrydding teknologi har mange utfordringer, utsiktene til denne teknologien levere en kurativ terapi er fortsatt veldig spennende. Dette fremheves av det faktum at litteraturen på dette området ekspanderer raskt, samt av det faktum at som nevnt tidligere fase II kliniske studier for EN HIV/AIDS-behandling ved hjelp av DENNE teknologien med CCR5-genmålretting allerede er i gang . Selv med denne observasjonen er det rimelig å forvente at denne typen terapi fortsatt er minst 5-10 år unna å kunne betraktes som en effektiv terapi hos mennesker. Men med den stadig skiftende frekvensen av eksperimentelle fremskritt, vil tidslinjen bli raskere enn forventet. Dette kan avhenge av vanskeligheter som oppstår i leveringsteknologier for å lette studier designet for å angripe HIV – 1 reservoarer utover perifert blod og regionale lymfeknuter. På dette tidspunktet oppveier utfordringene fortsatt suksessene til dags dato i de tidlige utviklingsstadiene; dette er imidlertid vanligvis en sann uttalelse for enhver ny terapeutisk tilnærming. Det er klart at eksisjonsstrategien representerer den eneste eksperimentelle terapeutiske strategiske som kan oppnå fullstendig eliminering av kromosombaserte defekte og aktiveringskompetente provirus. I den ikke for fjerne fortiden syntes dette å være et uoppnåelig mål; dette synes ikke lenger å være tilfelle.

Legg igjen en kommentar

Din e-postadresse vil ikke bli publisert.