HIV kimetszés CRISPR/Cas9 technológia felhasználásával: a Provirális Kvázifajok megtámadása a tározókban a gyógyulás elérése érdekében | Rivoluzione

eredmények és megbeszélés

a grns tervezési elvei korlátozzák a lehetséges szekvenciacélok szélességét, és nem világos, hogy hány grns-t lehet szállítani egyetlen kezelés alatt. Eredetileg azt hitték, hogy a grns-eknek pontosan meg kell egyezniük egy 20 nukleotid primerrel, amelyet az NGG PAMmotif követ, de a Hsu és munkatársai nemrégiben végzett kutatása bonyolultabb kapcsolatot írt le. Nemlineáris kapcsolat van az eltérések helyzete és a későbbi kötésre gyakorolt hatás között, ami azt jelenti, hogy a céltól eltérő hatások előrejelzéséhez többre lesz szükség, mint egy szokásos ROBBANÁSKERESÉSI megközelítés. Ezenkívül a terminális PAM motívum követelménye tovább korlátozza a megcélozható pozíciók számát A HIV genomjában. Mint ilyen, ezeknek a tényezőknek a kombinációja a VQ-k variabilitásával együtt azt jelzi, hogy a HIV-fertőzött populációnak lehet egy olyan alcsoportja, amelyre nem lehet teljes sémát kialakítani.

néhány tanulmány, amely megvizsgálta a nyugalmi CD4 + memória T-sejt tartályt, kimutatta, hogy az ezekből a sejtekből indukálható vírus kvázifajok egyre inkább homeosztatikussá válnak, minél hosszabb ideig tartják fenn a beteget a HAART-on . Ezek a vizsgálatok azonban nem vették figyelembe a nem indukált provírust. Elemeztük a Drexel gyógyszerbe beiratkozott HIV-1-fertőzött betegek szekvenálási eredményeit CNS AIDS kutatási és felszámolási vizsgálat (CARES) kohorsz, amely azt mutatja, hogy az integrált provírusból származó LTR domináns szekvenciája a pbmc rekesz a variáció mennyiségének csökkenését mutatja évente, a terápia típusától függetlenül (1a. ábra), de ez a vírus továbbra is folyamatos genetikai változáson megy keresztül ezekben a sejtekben a domináns genotípus legalább 6 évig, miközben hatékony szuppresszív ART-n van, állandó medián 10-20 egyedi mutáció évente az egész LTR-ben (1b. ábra). Úgy tűnik, hogy az évi variáció mértéke eléri a hatéves határ körüli fennsíkot, de további vizsgálatokra lesz szükség a látszólagos megfigyelés további dokumentálásához. Tekintettel ezekre az eredményekre, elengedhetetlen a következő generációs szekvenálás használata a jól kontrollált beteg tartályában lévő összes VQ meghatározásához. Ennek a megközelítésnek a használata lehetővé teszi egy olyan grns-kezelés megtervezését, amely megszünteti az összes VQ-t, amely jelen van a kivágási terápiával. Ez kiküszöbölné annak megértését, hogy egy adott fertőzött sejt rendelkezik-e replikációval Kompetens vírussal, vagy sem, mivel elméletileg kiküszöbölné az adott sejtpopulációban jelen lévő összes HIV-1 célpontot.

HIV LTR genetikai variáció és grns tervezés jól kontrollált betegeknél

az egymást követő látogatásokat összehasonlítottuk az egyes betegek összes szekvenciájának egyedi összehangolásával az IZOMBEIGAZÍTÓ eszköz segítségével, és kiszámítottuk az egymást követő látogatások közötti eltérések számát. A 100 BP-nkénti nukleotidváltozások számát A kiindulási látogatás óta eltelt idővel ábrázoltuk, hogy meghatározzuk a felhalmozódott variációk sebességét.

A: Az egyes betegek Vonalszegmenseit az antiretrovirális terápia (ART) státuszán alapuló longitudinális variációból állítottuk elő egymást követő látogatások között a következő kódolási séma alkalmazásával: a zöld vonalszakaszok egy longitudinális látogatást jeleznek, amelyben a beteg naiv volt az ART-val szemben (21 beteg), a piros vonalszakaszok az off/nem tapadó ART-látogatásokat jelzik (39 beteg), a szürke vonalszakaszok az on/tapadó ART-látogatásokat jelzik (168 beteg), és a fekete vonalszakaszok az ART/tapadó (54 beteg) vírusterheléssel mindig 100 kópia / ml alatt. A felső panel betegenként az összes hosszanti mintát ábrázolja. Az alsó panel az egyes csoportok medián és szórását mutatja minden évben.

B: Az LTRs – T 45, ART-t kapó/tapadó betegből és 31, legalább három egymást követő látogatáson nem folytonos ART-ban szenvedő betegből elemezték, mint az A-ban.az egyes betegek pályáját szürke színnel, a medián piros színnel, a felső és az alsó kvartilis kék színnel mutatjuk be.

C: A Roche 454 next generation szekvenálás (NGS) felhasználásával 6 beteg Pbmc-jéből izolált genomi DNS-t és 8 mintát végeztünk a HIV Genom 4,4 kb-os fragmentumán, a korábban leírtak szerint . A grns-ek számát és a célhelyzetet minden szekvenált beteg esetében úgy határoztuk meg, hogy a rövid leolvasású szekvenciákat a HXB2 genomhoz igazítottuk a BWA aligner és a CRISPR tervező eszköz által használt algoritmus helyi implementációja segítségével . A 23-mer tolóablakokat az összes teljesen átfedő leolvasás kivonásával és a PAM-szekvencia ellenőrzésével készítették; az összes ablakot, amely kevesebb, mint 50 átfedő olvasást tartalmaz, kizárták. Az egyes megcélozható ablakok hasításához szükséges grns-ek minimális számát az összes lehetséges grns tesztelésével számítottuk ki.

D: A 17. beteg 3. látogatásának NGS-leolvasásait a fent leírt BWA aligner segítségével hxb2-re térképeztük fel, és megvizsgáltuk a százalékos megőrzést (zöld vonal) és az összes ismert kvázifaj (piros vonal) kivágásához szükséges grns-ek számát az LTR minden helyzetében. A pozíció és a szám táblázata a grafikon alatt található.

a Roche 454 next generation szekvenálás (NGS) felhasználásával NGS-t végeztünk 6 beteg és 8 Minta Pbmc-jéből izolált genomi DNS-en, hogy megbecsüljük a HIV-1 LTR megőrzését és a betegenként potenciálisan szükséges grns-ek számát az összes ismert kvázifaj megcélzásához. A grns felépítésének korlátozása miatt a teljes grns-kezelést csak 4 betegmintára lehetett megtervezni a 8-ból (1C ábra). Azonban azok közül, amelyeket meg lehet tervezni, egyetlen beteglátogatási mintának sem volt szüksége több mint 10 grns-re ahhoz, hogy egy adott beteg teljes kvázifaját megcélozza. Ez azt mutatja, hogy a betegek egy részhalmaza számára, még azok számára is, akiknek vírusterhelése meghaladja az 50 kópia/mL-t, 10 grns-nél kisebb kezelési rendet lehet kidolgozni; fordítva, a betegek egy másik részhalmaza számára, még akkor is, ha vírusterhelésük 50 kópia/mL alatt van, egyetlen kezelési mód sem képes teljesen kivágni fertőzésüket.

az NGS minták közül a hat beteg közül kettőt hosszirányban teszteltek 11 hónapos különbséggel. Ezeknek a betegeknek a hosszanti mintáit vizsgálva az LTR variációjának mennyisége konzerváltabbá válik (azonban nem hiányzik a genetikai variáció) az egész szekvencia (az adatok nem láthatók). Az egyik ilyen beteg, az a0017 beteg érdekes esetet mutat be. A beviteli látogatáson, amikor hat évig HAART-on voltak, az A0017 beteget nem lehetett volna teljesen kezelni CRISP / Cas9 kivágási terápiával. A HAART terápia egy másik éve alatt lehetőség nyílt 10 grns-nél kisebb kivágási rend megtervezésére különböző helyeken, hogy képes legyen lefedni az összes ismert kvázifajt a PBMC populációból (1D ábra). Ez azt jelzi, hogy a vQS mozgó célpont, és a terápiás ablak korlátozott lesz egy adott grns-készletre, még a jelenleg elérhető leghatékonyabb terápiák mellett is. Ez azt is jelzi, hogy genomszinten szekvenálni kell a grns-ek fejlettebb kiválasztását több régióból, nem pedig rövidebb olvasmányokat, amelyeket a 454 vagy az Illumina szekvenálási stratégiák nyújtanak. Ezek az eredmények együttesen azt sugallták, hogy az NGS technikák alkalmazása nemcsak a sejtpopulációkban jelen lévő összes kvázifaj azonosítását eredményezheti, hanem azt is, hogy a szükséges grns-ek száma elég alacsony lesz ahhoz, hogy potenciálisan be lehessen csomagolni szállítási rendszerek, például számos vírusvektorozási stratégia bármelyike. Mint bemutattuk, az összes integrált vírusos LTR megcélzásának kihívása összetett lesz, de minden bizonnyal megvalósítható.

az összes integrált vírus kivágásához szükséges grns-ek megtervezésének kihívásával együtt a másik nagy kihívás a grns-ek szállítása lesz. Az egyik feltételezett módszer a lentivirális Vektorok használata. Ez a fajta szállítási rendszer lehetővé tenné hasonló sejttípusok fertőzését, amelyeket a HIV természetesen fertőz, potenciálisan korlátozva a terápia leadását nem fertőzött célsejtekre. Ezeknek a látens sejtekbe történő bejuttatásának hatékonyságát azonban bonyolíthatja mind az ilyen típusú sejtek fertőzőképessége, mivel ismert, hogy csökkent képességük van a sejt inaktivitása miatt, valamint a sejtek, amelyeket HIV fertőzött, amelyek rezisztensebb fenotípussal rendelkeznek a másodlagos HIV-fertőzéssel szemben. Az ilyen típusú rendszerek másik korlátozása kétségtelenül az lesz, hogy hány grns-t lehet csomagolni egy vektorba annak biztosítása érdekében, hogy amikor a lentivírus vektorrendszer megfertőzi a sejtet, akkor az összes szükséges grns jelen lesz. Hogy mi lesz a határ, azt még meg kell határozni. Végül az olyan szállítási rendszerekkel, mint a lentivrus Vektorok, még akkor is, ha a fent említett akadályok meghaladhatók, a grns-ek eljuttatása a szöveti rezidens sejtekbe, amelyek száma nagyon alacsony lehet, és az érrendszeri gátakon keresztüli migrációt igényelnek, további kihívást jelent.

tekintettel ezekre a kihívásokra, azonnali tanulmányokra van szükség e kérdések feltárásához. A vírus genotípusát illetően az első kérdés a tározósejtekben, például a CD4 memória T-sejt populációjában visszatartott VQ-k genetikai felépítésére összpontosít, és hogy ezek a vírusok hasonlóak-e vagy jelentősen különböznek-e a monocita-makrofág vonal sejtjeiben visszatartott VQ-któl, majd meghatározni ezeket a különbségeket az LTR célzással járó vírusirtás tekintetében? Mély szekvenálási vizsgálatokat kell végezni jól meghatározott betegpopulációkban hosszú fragmentum PCR technikák alkalmazásával a megfelelő grns tervezéshez. Ezenkívül a vírus genotípusának kompartmentalizálása más szövetekben bonyolíthatja a képet egyedi vírusgenotípusok bevezetésével a perifériás vérhez képest. A mély szekvenálási vizsgálatok azonban azt tapasztalhatják, hogy vannak olyan vírusrégiók, amelyek még több szövetben is erősen megőrződnek.

másodszor, mi a vírusdinamika ezekben a sejtekben? Mennyi ideig kell a betegnek ART-on lennie ahhoz, hogy a tározóban a vírus szelekcióját olyan szintre vezesse, ahol a jelenlévő kvázifajok száma elég alacsony ahhoz, hogy korlátozza a virális provirális DNS visszatartásának felszámolásához szükséges grns-eket ezekben a szövetekben? A betegek szekvenálása, különösen a sejtek szubpopulációs szintjén, a vírus dinamikájának teljes megértése érdekében jól kontrollált betegekre lesz szükség. Ezt a kihívást a CRISPR/Cas9 rendszer szállításának előrehaladása kezelheti, amely lehetővé teszi a grns-ek nagyobb kazettáinak leküzdését a megfigyelt változékonyság még hosszan tartó terápia után is.

végül ex vivo a koncepció bizonyítéka a memória T-sejt populációval kezdődő vizsgálatokra lesz szükség annak meghatározásához, hogy a vírus felszámolható-e a HIV-1-fertőzött betegből származó sejtekből egy jól kontrollált kísérleti környezetben egysejtű T-sejt populációkon belül, amelyeket In vitro tenyésztettek HIV-1-fertőzött betegekből.

összességében, míg az ilyen típusú HIV-1 felszámolási technológiának számos kihívása van, ennek a gyógyító terápiát biztosító technológiának a kilátásai továbbra is nagyon izgalmasak. Ezt hangsúlyozza az a tény, hogy a szakirodalom ezen a területen gyors ütemben bővül, valamint az a tény, hogy amint azt korábban említettük, II .fázisú klinikai vizsgálatok egy HIV/AIDS kezelésére ezt a technológiát alkalmazva CCR5 gén célzással már folyamatban van. Még ezzel a megfigyeléssel is ésszerű elvárni, hogy az ilyen típusú terápia még mindig legalább 5-10 évre van attól, hogy hatékony terápiának lehessen tekinteni az emberekben. A kísérleti előrehaladás folyamatosan változó ütemével azonban talán az idővonal a vártnál gyorsabb lesz. Ez függhet a szállítási technológiák nehézségeitől, amelyek megkönnyítik a HIV-1 tartályok megtámadását a perifériás véren és a regionális nyirokcsomókon túl. Ezen a ponton a kihívások még mindig meghaladják a fejlődés korai szakaszában elért sikereket; ez azonban általában igaz állítás minden új terápiás megközelítéshez. Nyilvánvaló, hogy a kimetszési stratégia az egyetlen kísérleti terápiás stratégia, amely elérheti a kromoszóma alapú hibás és aktivációs Kompetens provírusok teljes eliminációját. A nem túl távoli múltban ez elérhetetlen célnak tűnt; úgy tűnik, hogy ez már nem így van.

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.