Excision du VIH Utilisant la technologie CRISPR / Cas9: Attaquer les Quasi-espèces Provirales dans les réservoirs pour obtenir un traitement | Rivoluzione

Résultats et discussion

Les principes de conception des ARNG limitent l’étendue des cibles de séquence possibles et on ne sait pas combien d’ARNG peuvent être administrés en un seul régime. À l’origine, on pensait que les ARNG nécessitaient une correspondance exacte avec une amorce nucléotidique 20 suivie du PAMmotif NGG, mais des recherches récentes menées par Hsu et ses collègues ont décrit une relation plus compliquée. Il existe une relation non linéaire entre la position des non-appariements et l’effet sur la liaison ultérieure, ce qui implique que la prédiction des effets hors cible nécessitera plus qu’une approche standard de recherche par EXPLOSION. De plus, l’exigence d’un motif PAM terminal limite encore le nombre de positions ciblables dans le génome du VIH. En tant que tel, la combinaison de ces facteurs et la variabilité des QV indique qu’il peut y avoir un sous-ensemble de la population infectée par le VIH pour lequel un régime complet ne peut pas être conçu.

Certaines études qui ont examiné le réservoir de lymphocytes T à mémoire CD4 + au repos ont montré que les quasi-espèces virales qui peuvent être induites à partir de ces cellules commencent à devenir plus homéostatiques plus un patient est maintenu longtemps sous HAART. Cependant, ces études n’ont pas pris en compte le provirus non induit. Nous avons analysé les résultats de séquençage de patients infectés par le VIH-1 inscrits dans la cohorte Drexel Medicine CNS AIDS Research and Eradication Study (CARES) qui montrent que la séquence prédominante de la LTR provenant du provirus intégré dans le compartiment PBMC présente une diminution de la quantité de variation par an quel que soit le type de traitement (Figure 1A), mais que ce virus subit toujours un changement génétique continu du génotype prédominant dans ces cellules pendant au moins 6 ans alors qu’il est sous TAR suppressif efficace avec une médiane constante de 10 à 20 mutations uniques par an tout au long de la LTR entière (Figure 1B). La quantité de variation par année semble atteindre un plateau autour de la barre des six ans, mais des études supplémentaires seront nécessaires pour documenter davantage cette observation apparente. Compte tenu de ces résultats, il est essentiel d’utiliser le séquençage de nouvelle génération pour déterminer tous les QV présents dans le réservoir d’un patient bien contrôlé. L’utilisation de cette approche permettra de concevoir un régime d’ARNr qui éliminera tous les QV présents avec la thérapie par excision. Cela éliminerait la nécessité de comprendre si une cellule infectée donnée a un virus compétent pour la réplication ou non, car en théorie, cela éliminerait toutes les cibles du VIH-1 présentes dans une population cellulaire donnée.

La variation génétique de la LTR du VIH et la conception de l’ARNr chez des patients bien contrôlés

Visites consécutives ont été comparées en alignant individuellement toutes les séquences de chaque patient à l’aide de l’outil d’alignement MUSCULAIRE et en calculant le nombre de variations entre les visites consécutives. Le nombre de changements de nucléotides par 100 bp a été tracé par rapport au temps écoulé depuis la visite de base pour déterminer le taux de variations accumulées.

A: Des segments de ligne de chaque patient ont été générés à partir de la variation longitudinale basée sur l’état du traitement antirétroviral (TAR) entre des visites consécutives en utilisant le schéma de codage suivant: les segments de lignes vertes indiquent une visite longitudinale au cours de laquelle le patient était naïf vis-à-vis du TAR (21 patients), les segments de lignes rouges indiquent des visites antirétrovirales / non adhérentes (39 patients), les segments de lignes grises indiquent des visites antirétrovirales / adhérentes (168 patients) et les segments de lignes noires sur / adhérentes (54 patients) avec des charges virales toujours inférieures à 100 copies par ml. Le panneau supérieur représente tous les échantillons longitudinaux par patient. Le panneau inférieur montre l’écart médian et l’écart-type pour chaque groupe à chaque année.

D: Les LTR de 45 patients sous TAR / adhérent et de 31 patients avec TAR discontinu pendant au moins trois visites consécutives ont été analysés comme dans A. La trajectoire de chaque patient est indiquée en gris avec la médiane en rouge et les quartiles supérieur et inférieur en bleu.

C: En utilisant le séquençage Roche 454 next generation (NGS), le NGS sur de l’ADN génomique isolé à partir de PBMC de 6 patients et 8 échantillons a été réalisé sur un fragment de 4,4 kb du génome du VIH, comme décrit précédemment. Le nombre d’ARNG et la position cible pour chaque patient séquencé ont été déterminés en alignant les séquences à lecture courte sur le génome HXB2 à l’aide de l’aligneur BWA et d’une implémentation locale de l’algorithme utilisé par l’outil de conception CRISPR. les fenêtres coulissantes 23-mer ont été construites en extrayant toutes les lectures qui se chevauchent complètement et en vérifiant une séquence PAM; toutes les fenêtres avec moins de 50 lectures qui se chevauchent ont été exclues. Le nombre minimal de GRNA requis pour cliver chaque fenêtre ciblable a été calculé en testant tous les GRNA possibles.

D: Les lectures de NGS de la visite du patient 17 3 ont été cartographiées à HXB2 à l’aide de l’aligneur BWA tel que décrit ci-dessus et examinées pour le pourcentage de conservation (ligne verte) et le nombre d’ARNG nécessaires à l’excision de toutes les quasi-espèces connues (ligne rouge) à chaque position du LTR. Un tableau de la position et du numéro est fourni sous le graphique.

En utilisant le séquençage de nouvelle génération (NGS) de Roche 454, nous avons effectué des NGS sur de l’ADN génomique isolé à partir de PBMC de 6 patients et de 8 échantillons afin d’obtenir une appréciation de la conservation du LTR VIH-1 et du nombre d’ARNG potentiellement nécessaires par patient pour cibler toutes les quasi-espèces connues. En raison de la limitation de la construction de l’ARNr, un régime complet d’ARNr n’a pu être conçu que pour 4 des 8 échantillons de patients (figure 1C). Cependant, parmi ceux qui pouvaient être conçus, aucun échantillon de visite de patient n’avait besoin de plus de 10 ARNG pour cibler la quasi-espèce entière chez un patient donné. Cela montre que pour un sous-ensemble de patients, même ceux avec des charges virales supérieures à 50 copies / mL, un schéma thérapeutique avec moins de 10 ARNG peut être conçu; inversement, pour un autre sous-ensemble de patients, même s’ils ont des charges virales inférieures à 50 copies / mL, aucun schéma thérapeutique ne peut complètement exciser leur infection.

Des échantillons de NGS, deux des six patients ont été testés longitudinalement à 11 mois d’intervalle. En examinant les échantillons longitudinaux de ces patients, la quantité de variation de la LTR devient plus conservée (mais ne manque pas de variation génétique) sur toute la séquence (données non montrées). L’un de ces patients, le patient A0017, présente un cas intéressant. Lors de la visite d’admission, à laquelle ils étaient sous HAART depuis six ans, le patient A0017 n’aurait pas pu être complètement traité avec un traitement par excision CRISP / Cas9. Au cours d’une autre année de thérapie HAART, il a été possible de concevoir un régime d’excision de moins de 10 ARNG à divers sites afin de pouvoir couvrir toutes les quasi-espèces connues de la population de PBMC (figure 1D). Cela indique que le vQS est une cible mobile et que la fenêtre thérapeutique sera limitée pour un ensemble donné d’ARNG, même avec les thérapies les plus efficaces actuellement disponibles. Cela indique également la nécessité d’un séquençage au niveau du génome pour permettre une sélection plus avancée des ARNG de plusieurs régions plutôt que des lectures plus courtes que les stratégies de séquençage 454 ou Illumina fourniront. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que l’utilisation de techniques de SNG peut non seulement permettre d’identifier toutes les quasi-espèces présentes dans les populations cellulaires, mais également que le nombre d’ARNG nécessaires sera suffisamment faible pour être potentiellement emballés dans des systèmes d’administration tels que l’une des nombreuses stratégies de vectorisation virale. Comme on l’a démontré, le défi de cibler tous les RTL viraux intégrés sera complexe, mais certainement réalisable.

Outre le défi de concevoir les ARNG nécessaires à l’excision de tous les virus intégrés, l’autre défi majeur sera la livraison des ARNG. Une façon qui a été émise est l’utilisation de vecteurs lentiviraux. Ce type de système d’administration permettrait l’infection de types cellulaires similaires que le VIH infecte naturellement, limitant potentiellement l’administration du traitement aux cellules non infectées hors cible. Cependant, l’efficacité de l’utilisation de ceux-ci pour les délivrer aux cellules latentes peut être compliquée à la fois par l’infectabilité de ces types de cellules car elles sont connues pour avoir une capacité diminuée en raison de l’inactivité de la cellule et des cellules, qui ont été infectées par le VIH ayant un phénotype plus résistant à l’infection secondaire par le VIH. Une autre limitation de ce type de système sera sans aucun doute le nombre d’ARNG pouvant être emballés dans un vecteur pour s’assurer que lorsque le système vectoriel lentivirus infecte une cellule, tous les ARNG potentiels nécessaires seront présents. Quelle sera la limite doit encore être définie. Enfin, avec des systèmes d’administration tels que les vecteurs lentivrus, même si les obstacles mentionnés ci-dessus peuvent être dépassés, l’administration des ARNG aux cellules résidentes des tissus qui peuvent avoir un nombre très faible et nécessiter une migration à travers les barrières vasculaires constituera un niveau supplémentaire de défi.

Compte tenu de ces défis, des études immédiates sont nécessaires pour explorer ces questions. En ce qui concerne le génotype viral, la première question se concentrera sur la constitution génétique des VQS retenus dans les cellules réservoirs comme la population de lymphocytes T à mémoire CD4 et si ces virus sont similaires ou significativement différents des vQS retenus dans les cellules de la lignée monocyte-macrophage, puis pour définir ces différences par rapport à l’éradication virale impliquant le ciblage LTR? Des études de séquençage approfondi dans des populations de patients bien définies devront être effectuées à l’aide de techniques de PCR à fragments longs pour une conception correcte de l’aRNG. De plus, la compartimentation du génotype viral dans d’autres tissus peut compliquer le tableau avec l’introduction de génotypes viraux uniques par rapport au sang périphérique. Cependant, des études approfondies de séquençage peuvent révéler qu’il existe des régions virales de conservation élevée, même dans plusieurs tissus.

Deuxièmement, quelles sont les dynamiques virales dans ces cellules? Combien de temps un patient doit-il être sous TAR pour conduire la sélection du virus dans le réservoir à un niveau où le nombre de quasi-espèces présentes est suffisamment faible pour limiter les ARNG nécessaires pour éradiquer la rétention de l’ADN proviral viral dans ces tissus? Le séquençage des patients, en particulier aux niveaux de sous-population cellulaire, pour avoir une compréhension complète de la dynamique virale chez des patients bien contrôlés sera nécessaire. Ce défi peut être relevé par des progrès dans l’administration du système CRISPR / Cas9 permettant à de plus grandes cassettes d’ARNG de surmonter la variabilité observée même après un traitement prolongé.

Enfin, des études de preuve de concept ex vivo commençant par la population de lymphocytes T mémoire seront nécessaires pour déterminer si le virus peut être éradiqué des cellules dérivées de patients infectés par le VIH-1 dans un environnement expérimental bien contrôlé au sein de populations de lymphocytes T unicellulaires cultivées in vitro à partir de patients infectés par le VIH-1.

Dans l’ensemble, bien que ce type de technologie d’éradication du VIH-1 présente de nombreux défis, les perspectives de cette technologie offrant une thérapie curative restent très intéressantes. Ceci est mis en évidence par le fait que la littérature dans ce domaine se développe à un rythme rapide ainsi que par le fait que, comme mentionné précédemment, des essais cliniques de phase II pour un traitement du VIH / sida utilisant cette technologie avec ciblage du gène CCR5 sont déjà en cours. Même avec cette observation, il est raisonnable de s’attendre à ce que ce type de thérapie soit encore au moins 5 à 10 ans avant de pouvoir être considéré comme un traitement efficace chez l’homme. Cependant, avec le rythme en constante évolution des progrès expérimentaux, le calendrier sera peut-être plus rapide que prévu. Cela peut dépendre des difficultés rencontrées dans les technologies d’administration pour faciliter les études conçues pour attaquer les réservoirs du VIH-1 au-delà du sang périphérique et des ganglions lymphatiques régionaux. À ce stade, les défis l’emportent encore sur les succès obtenus à ce jour dans les premiers stades de développement; cependant, il s’agit généralement d’une véritable déclaration pour toute nouvelle approche thérapeutique. De toute évidence, la stratégie d’excision représente la seule stratégie thérapeutique expérimentale pouvant permettre l’élimination complète des provirus défectueux et compétents en activation basés sur les chromosomes. Dans un passé pas si lointain, cela semblait être un objectif irréalisable; cela ne semble plus être le cas.

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