HIV excize využívající technologii CRISPR / Cas9: útok na Provirální Kvasidruhy v nádržích za účelem dosažení vyléčení | Rivoluzione

výsledky a diskuse

principy návrhu gRNA omezují šíři možných sekvenčních cílů a není jasné, kolik gRNA může být dodáno v jednom režimu. Původně se předpokládalo, že gRNA vyžadují přesnou shodu a 20 nukleotidový primer následovaný NGG PAMmotif, ale nedávný výzkum Hsu a spolupracovníků popsal složitější vztah. Existuje nelineární vztah mezi pozicí nesouladů a účinkem na následnou vazbu, což znamená, že předpovídání off-cílových efektů bude vyžadovat více než standardní přístup k vyhledávání výbuchů. Dále požadavek na terminální motiv PAM dále omezuje počet cílových pozic v genomu HIV. Kombinace těchto faktorů spolu s variabilitou VQ naznačuje, že může existovat podskupina populace infikované HIV, pro kterou nelze navrhnout Kompletní režim.

některé studie, které zkoumaly rezervoár T-buněk v klidové paměti CD4+, ukázaly, že virové kvasidruhy, které mohou být indukovány z těchto buněk, se začínají stát více homeostatickými, čím déle je pacient udržován na HAART . Tyto studie však nezohlednily neindukovaný provirus. Analyzovali jsme výsledky sekvenování od pacientů infikovaných HIV-1 zařazených do kohorty Drexel Medicine CNS AIDS Research and Eradication Study (CARES), které ukazují, že převládající sekvence LTR z integrovaného proviru v kompartmentu PBMC vykazuje pokles množství variací za rok bez ohledu na typ terapie (obrázek 1A), ale že tento virus stále prochází pokračující genetickou změnou převládajícího genotypu v těchto buňkách po dobu nejméně 6 let, zatímco na účinném supresivním ART s konstantním mediánem 10-20 jedinečných mutací za rok po celou dobu LTR (Obrázek 1B). Zdá se, že množství variací za rok dosahuje plató kolem šestileté známky, ale k dalšímu zdokumentování tohoto zjevného pozorování budou vyžadovány další studie. Vzhledem k těmto výsledkům je nezbytné použít sekvenování nové generace k určení všech VQ přítomných v dobře kontrolovaném rezervoáru pacienta. Použití tohoto přístupu umožní návrh režimu gRNA, který eliminuje všechny VQ přítomné s excizní terapií. To by eliminovalo potřebu pochopit, zda daná infikovaná buňka má replikační Kompetentní virus nebo ne, protože teoreticky by to eliminovalo všechny cíle HIV-1 přítomné v dané buněčné populaci.

HIV LTR genetická variace a gRNA design u dobře kontrolovaných pacientů

po sobě jdoucí návštěvy byly porovnány individuálním zarovnáním všech sekvencí od každého pacienta pomocí nástroje pro zarovnání svalů a výpočtem počtu variací mezi po sobě jdoucími návštěvami. Počet změn nukleotidů na 100 BP byl vynesen proti době od základní návštěvy, aby se určila rychlost nahromaděných variací.

A: segmenty čáry od každého pacienta byly generovány z podélné variace založené na stavu antiretrovirové terapie (ART) mezi po sobě jdoucími návštěvami pomocí následujícího kódovacího schématu: segmenty zelené čáry označují podélnou návštěvu, při které byl pacient naivní vůči ART (21 pacientů), segmenty červené čáry označují off / non-adherent ART návštěvy (39 pacientů), segmenty šedé čáry označují on / adherent Art návštěvy (168 pacientů) a segmenty černé čáry on/adherent ART (54 pacientů)s virovou zátěží vždy pod 100 kopií na ml. Horní panel zobrazuje všechny podélné vzorky na pacienta. Spodní panel zobrazuje medián a směrodatnou odchylku pro každou skupinu v každém roce.

B: Ltr od 45 pacientů na / adherentní ART a 31 pacientů s diskontinuální ART po dobu nejméně tří po sobě jdoucích návštěv byly analyzovány jako v a. trajektorie každého pacienta je zobrazena šedě s mediánem v červené barvě a horní a dolní kvartily modře.

C: Použití sekvenování nové generace Roche 454 (NGS), NGS na genomové DNA izolované z Pbmc 6 pacientů a 8 vzorků bylo provedeno na fragmentu genomu HIV 4, 4 kb, jak bylo dříve popsáno . Počet gRNA a cílová pozice pro každého sekvenovaného pacienta byla stanovena zarovnáním sekvencí krátkého čtení s genomem HXB2 pomocí aligneru BWA a lokální implementace algoritmu používaného návrhovým nástrojem CRISPR . 23-Mer posuvná okna byla konstruována extrahováním všech zcela překrývajících se čtení a zkontrolována sekvence PAM; všechna okna s méně než 50 překrývajícími se čteními byla vyloučena. Minimální počet gRNA potřebných k štěpení každého cílového okna byl vypočítán testováním všech možných gRNA.

D: Čtení NGS z návštěvy pacienta 17 3 byly mapovány na hxb2 pomocí zarovnávače BWA, jak je popsáno výše, a vyšetřeno na procentuální zachování (zelená čára) a počet gRNA nezbytných pro vyříznutí všech známých kvasidruhů (červená čára) v každé poloze LTR. Tabulka pozice a čísla je uvedena pod grafem.

s využitím sekvenování nové generace Roche 454 (NGS) jsme provedli NGS na genomové DNA izolované z Pbmc 6 pacientů a 8 vzorků, abychom získali ocenění za zachování HIV-1 LTR a počet gRNA potenciálně potřebných na pacienta k cílení na všechny známé kvasidruhy. Vzhledem k omezení konstrukce gRNA mohl být kompletní režim gRNA navržen pouze pro 4 z 8 vzorků pacientů (obrázek 1C). Z těch, které by mohly být navrženy, však žádný vzorek návštěvy pacienta nepotřeboval více než 10 gRNA k zacílení na celý kvazidruh u daného pacienta. To ukazuje, že pro podskupinu pacientů, dokonce i pacientů s virovou zátěží nad 50 kopií / mL, lze navrhnout režim s méně než 10 gRNA; naopak, pro jinou podskupinu pacientů, i když mají virovou zátěž pod 50 kopií/mL, žádný režim nemůže zcela vyloučit jejich infekci.

ze vzorků NGS byli dva ze šesti pacientů testováni podélně s odstupem 11 měsíců. Při pohledu na podélné vzorky od těchto pacientů se množství variací v LTR stává konzervovanějším (nicméně chybí genetická variace) v celé sekvenci (údaje nejsou zobrazeny). Jeden z těchto pacientů, pacient a0017, představuje zajímavý případ. Při vstupní návštěvě, kdy byli na HAART šest let, nemohl být pacient a0017 zcela léčen excizní terapií CRISP/Cas9. V průběhu dalšího roku terapie HAART bylo možné navrhnout režim excize menší než 10 gRNA na různých místech, aby bylo možné pokrýt všechny známé kvasidruhy z populace PBMC (obrázek 1D). To naznačuje, že vQS je pohyblivým cílem a terapeutické okno bude pro danou sadu gRNA omezeno i při nejúčinnějších terapiích, které jsou v současné době k dispozici. To také naznačuje potřebu sekvenování na úrovni genomu, aby se umožnil pokročilejší výběr gRNA z více oblastí, spíše než kratší čtení, které 454 nebo Illumina sekvenční strategie poskytne. Společně tyto výsledky naznačují, že použití technik NGS může vést nejen k identifikaci všech kvasidruhů přítomných v buněčných populacích, ale také k tomu, že počet potřebných gRNA bude dostatečně nízký, aby mohl být potenciálně zabalen do doručovacích systémů, jako je některá z řady strategií virového vektorování. Jak bylo prokázáno, výzva cílení na všechny integrované virové ltr bude složitá, ale jistě proveditelná.

spolu s výzvou navrhování gRNA nezbytných pro vyříznutí všech integrovaných virů bude další hlavní výzvou dodávka gRNA. Jedním ze způsobů, který byl předpokládán, je použití lentivirových vektorů. Tento typ doručovacího systému by umožnil infekci podobných buněčných typů, které HIV přirozeně infikuje, potenciálně omezující dodávání terapie neinfikovaným cílovým buňkám. Účinnost jejich použití k přenosu do latentních buněk však může být komplikována jak infikovatelností těchto typů buněk, protože je známo, že mají sníženou schopnost v důsledku nečinnosti buňky, tak i buněk, které byly infikovány HIV, který má odolnější fenotyp vůči sekundární infekci HIV. Dalším omezením tohoto typu systému bude nepochybně to, kolik gRNA může být zabaleno do jednoho vektoru, aby se zajistilo, že když lentivirový vektorový systém infikuje buňku, budou přítomny všechny potřebné potenciální gRNA. Jaký bude limit, zatím není definováno. Konečně s doručovacími systémy, jako jsou vektory lentivrus, i když lze výše uvedené překážky překonat, dodávka gRNA do buněk rezidentních v tkáních, které mohou mít velmi nízký počet a vyžadují migraci přes cévní bariéry, bude další úrovní výzvy.

vzhledem k těmto výzvám je zapotřebí okamžitých studií k prozkoumání těchto problémů. Pokud jde o virový genotyp, první otázka se zaměří na genetické složení VQ zadržovaných v rezervoárových buňkách, jako je populace T-buněk paměti CD4, a na to, zda jsou tyto viry podobné nebo významně odlišné od VQ zadržovaných v buňkách linie monocytů a makrofágů,a poté definovat tyto rozdíly s ohledem na eradikaci viru zahrnující cílení LTR? Hluboké sekvenační studie u dobře definovaných populací pacientů bude nutné provést pomocí technik PCR s dlouhým fragmentem pro správný návrh gRNA. Kromě toho může kompartmentalizace virového genotypu v jiných tkáních komplikovat obraz zavedením jedinečných virových genotypů ve srovnání s periferní krví. Hluboké sekvenační studie však mohou zjistit, že existují virové oblasti s vysokou ochranou i ve více tkáních.

za druhé, jaká je virová dynamika v těchto buňkách? Jak dlouho musí být pacient na ART, aby řídil výběr viru v rezervoáru na úroveň, kde je počet přítomných kvasispecií dostatečně nízký, aby omezil gRNA potřebné k eradikaci retence virové provirové DNA v těchto tkáních? Sekvenování pacientů, zejména na úrovních buněčné subpopulace, k úplnému pochopení virové dynamiky u dobře kontrolovaných pacientů bude vyžadováno. Tuto výzvu lze řešit pokroky v dodávce systému CRISPR / Cas9, který umožňuje větším kazetám gRNA překonat variabilitu pozorovanou i po dlouhodobé léčbě.

konečně, ex vivo proof-of-concept studie začínající populací paměťových T-buněk budou vyžadovány k určení, zda může být virus eradikován z buněk odvozených od pacientů infikovaných HIV-1 v dobře kontrolovaném experimentálním prostředí v jednobuněčných T-buněčných populacích kultivovaných in vitro od pacientů infikovaných HIV-1.

celkově, zatímco tento typ technologie eradikace HIV-1 má mnoho výzev, vyhlídky na tuto technologii poskytující léčebnou terapii zůstávají velmi vzrušující. To je zdůrazněno skutečností, že literatura v této oblasti se rychle rozšiřuje a také skutečností, že jak již bylo zmíněno dříve, klinické studie fáze II pro léčbu HIV / AIDS pomocí této technologie s cílením na gen CCR5 již probíhají. I při tomto pozorování je rozumné očekávat, že tento typ terapie je ještě nejméně 5-10 let daleko od toho, aby mohl být považován za účinnou terapii u lidí. S neustále se měnící rychlostí experimentálního postupu však možná bude časová osa rychlejší, než se očekávalo. To může záviset na obtížích, se kterými se setkáváme v dodacích technologiích, aby se usnadnily studie určené k napadení rezervoárů HIV-1 mimo periferní krev a regionální lymfatické uzliny. V tomto okamžiku výzvy stále převažují nad dosavadními úspěchy v raných fázích vývoje; toto je však obvykle pravdivé tvrzení pro jakýkoli nový terapeutický přístup. Je zřejmé, že excizní strategie představuje jedinou experimentální terapeutickou strategii, která může dosáhnout úplné eliminace chromozomálních defektních a aktivačních kompetentních provirů. V ne do vzdálené minulosti se to zdálo být nedosažitelným cílem; zdá se, že tomu tak již není.

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.